Der ursprünglich aus Peru stammende Paddington Bär reist gemeinsam mit der Familie Brown bestehend aus Henry und Mary sowie den Kindern Jonathan und Judy und der Haushälterin Mrs. Bird von London in seine alte Heimat. Dort möchte er seine Tante Lucy besuchen, die in einem von Mutter Oberin geleiteten Seniorenheim für Bären lebt.

Allerdings ist Lucy verschwunden, Paddington begibt sich mit seinen Freunden auf die Suche nach ihr in den Amazonas-Regenwald. Unterstützt werden sie dabei von Flussschiffkapitän Hunter Cabot und dessen Tochter Gina.